睡菜醋酸乙酯部位化学成分及其神经保护作用研究（一）

目的睡菜神经研究神农架产睡菜Menyanthestrifoliate全草醋酸乙酯部位的化学成分及其神经保护作用。方法采用薄层色谱，醋酸成分正相硅胶、乙酯研究AB-8大孔树脂、部位保护SephadexLH-20葡聚糖凝胶及制备型HPLC等柱色谱方法分离纯化，化学利用NMR、作用MS等波谱学方法鉴定化合物结构。睡菜神经采用体外建立皮质酮诱导PC12细胞损伤模型，醋酸成分运用MTT方法的乙酯研究单体化合物对皮质酮诱导PC12细胞损伤的保护作用进行初步确认。结果从睡菜醋酸乙酯部位中得到了21个化合物，部位保护分别鉴定为4-O-咖啡酰奎尼酸甲酯（1）、化学绿原酸甲酯（2）、作用绿原酸（3）、睡菜神经异秦皮素（4）、醋酸成分异嗪皮啶（5）、乙酯研究7R,7′R,8S,8′S-(＋)-新-橄榄脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（6）、肿柄雪莲苷（7）、丁香脂素（8）、苏式-(7R,8R)-愈创木基丙三醇-8-香草醛醚（9）、(7S,8R)-二氢去氢二松柏醇-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（10）、(-)-落叶松脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（11）、山柰酚-3-O-芸香糖苷（12）、槲皮素-3-O-芸香糖苷（13）、去氢吐叶醇（14）、布卢门醇A（15）、黑麦草内酯（16）、(E)-6-羟基-2,6-二甲基辛-2,7-二烯酸甲酯（17）、3-甲氧基酚-1-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（18）、2-羟基苯并咪唑（19）、丁香醛（20）、1-苯基-1,2-乙二醇（21）。对化合物1～21进行了皮质酮诱导PC12细胞损伤的神经保护作用研究，结果显示，化合物1、2、3、7、9对皮质酮诱导PC12细胞损伤具有显著的保护作用，化合物4、5、10、11、15～17表现出中等的保护作用。结论 化合物1～9、11～12、14～21为首次从该植物中分离得到。

睡菜Menyanthes trifoliate L.为龙胆科睡菜属多年生水生植物，广布于北半球温带地区，我国西藏、云南、四川、贵州、黑龙江、吉林、辽宁及鄂西地区均有分布。又名“醉草、绰菜、瞑菜”。《本草纲目》记载：睡菜性甘微苦，寒，无毒，以单方入药，治心膈邪热，不得眠；《北方常用中草药手册》曰：睡菜味甘微苦，性温，无毒，能健脾消食，养心安神，治胃炎，胃痛，消化不良，心悸失眠，心神不安。据《南方草木状》记载：“睡菜，夏生于池沼间，叶类慈姑，根如藕条，南海人食之，云令人思睡，呼为瞑菜”。睡菜在民间药食两用。我国民间部分省市有采集睡菜做泡菜的习俗，吃后较为嗜睡，可以治疗失眠，有养心安神的功效。睡菜中主要含有环烯醚萜、挥发油、生物碱、甾体等类成分。

本课题组在前期研究中已证实睡菜提取物毒性较小且具有良好的镇静催眠活性，其中的醋酸乙酯部位具有显著地镇静催眠活性。《问斋医案》所云：“动甚则怔仲，令人惶惕不安，凄怆不乐，甚至心烦虑乱，不知所从，无故多思，寤不成寐”。阐明了焦虑与失眠有着密切联系，并在病因病机方面有着共通之处。有研究显示，失眠作为一项独立的危险因素，在焦虑状态的发病过程中起着决定性的作用。PC12细胞株来源于一种可移植的鼠嗜铬细胞瘤，分化的PC12细胞具有典型的神经元的功能，被广泛用于神经细胞分化、离子通道、受体、递质等研究领域。皮质酮是一种糖皮质激素，可导致海马神经元的病理损伤，从而诱导焦虑行为。这一特点使得高浓度皮质酮诱导PC12细胞损伤可模拟焦虑症神经细胞损伤状态。因此本研究通过建立皮质酮损伤的PC12细胞模型探究睡菜中抗焦虑活性有效物质，该研究结果为深入开发利用睡菜植物资源，以期发现具有抗焦虑活性的天然活性物质奠定基础。

1 仪器与试剂

Bruker AV 400型核磁共振波谱仪（瑞士布鲁克公司）；Thermo ISQ LT单四极杆气质联用仪（美国赛默飞公司）；Dionex Ultimate 3000型高效液相色谱仪（美国戴安公司）；Waters 1525 EF高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Venusil XBP C18色谱柱（半制备型；250 mm×10 mm，10 μm；分析型：250 mm×4.6 mm，5 μm，天津博纳艾杰尔科技有限公司）；低温冷冻干燥机（美国Labconco公司）；TECAN infinite F200 PRO酶标仪（瑞士帝肯公司）；荧光显微镜（宁波舜宇仪器有限公司XD30A-RFL）；CO2培养箱（德国binder公司）；低温离心机（德国Eppendorf公司）；SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；电子天平（上海民桥精密仪器有限公司）；正相色谱硅胶（烟台化学工业研究所）；反相色谱硅胶（日本YMC公司）；Sephadex LH-20（美国Pharmacia公司）；MCI GEL（日本三菱化学）；1640培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；皮质酮（美国Medchemexpress公司）；MTT（美国Amersco公司）；DMSO（美国Sigma公司）；高效液相用乙腈、甲醇均为色谱纯（美国Tedia公司）；水为三蒸水；其他试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。
睡菜全草于2018年9月采自湖北省神农架大九湖，经三峡大学生物与制药学院王玉兵博士鉴定为龙胆科睡菜属植物睡菜M. thestrifoliate L.的全草。植物标本现保存于三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室。
PC12高分化细胞，为三峡大学医学院提供。接种于含10%胎牛血清，2%谷氨酰胺的DMEM培养液中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

2 方法

2.1 提取与分离

睡菜干燥全草（6.3 kg）粉碎，用95%乙醇回流提取3次（60 L×3），每次2 h。将乙醇提取液减压浓缩干燥，得到睡菜醇提总浸膏1514 g，总浸膏加水均匀混悬，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液减压浓缩，得到石油醚萃取部位102 g、醋酸乙酯萃取部位172 g、正丁醇萃取部位350 g。

取醋酸乙酯萃取部位160 g，纯水溶解后，AB-8大孔吸附树脂柱色谱分离，依次用纯水、20%乙醇水、40%乙醇水、60%乙醇水、80%乙醇水、100%乙醇洗脱，减压浓缩干燥，得到纯水洗脱部位（13 g）、20%乙醇水洗脱部位（6 g）、40%乙醇水洗脱部位（34 g）、60%乙醇水洗脱部位（23 g）、60%乙醇水洗脱部位（30 g）、100%乙醇洗脱片段（50 g）。取40%乙醇水洗脱部位，用C18反相硅胶柱色谱分离，水-甲醇梯度洗脱，经HPLC分析合并，得到10个组分Fr. C1～C10。Fr. C3（1500 mg）经HW-20F凝胶柱分离，得到Fr. C3a～C3i；Fr.C3a经制备型HPLC（乙腈-水18∶82）纯化，得到化合物7（2.1 mg）、13（9.1 mg）、18（1.1 mg）、21（5.2 mg）；Fr.C3b经制备型HPLC（乙腈-水20∶80）纯化，得到化合物2（24.4 mg）、5（5.3 mg）；Fr.C3e经制备型HPLC（乙腈-水22∶78）纯化，得到化合物1（3.3 mg）、4（3.2 mg）、14（4.9 mg）、15（3.8 mg）；Fr.C3i经制备型HPLC（乙腈-水23∶77）纯化，得到化合物12（3.1 mg）、16（3.2 mg）、19（2.5 mg）。Fr.C6经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱色谱分离，得到Fr.C6a～C6d。Fr.C6c经制备型HPLC（乙腈-水＝24∶75）纯化，得到化合物3（11.7 mg）、8（3.1 mg）、9（3.1 mg）、10（8.1 mg）、11（30.1 mg）；Fr.C6d经制备型HPLC（乙腈-水24∶76）纯化，得到化合物6（10.1 mg）、17（3.9 mg）、20（2.3 mg）。

2.2 活性测试

2.2.1 皮质酮对PC12细胞的浓度选择

将浓度为1.5×105个/mL的处于对数生长期PC12细胞接种于96孔板，培养24 h后，分别加入终浓度为450、550、650、750、850、950、1050、1150 μmol/L皮质酮溶液，培养48 h后，每孔加入25 μL MTT（5 mg/mL）继续培养4 h后，弃上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜，震摇10 min后，于酶标仪570 nm波长处检测吸光度值。

2.2.2 实验分组及药物处理

将对数生长期的PC12细胞以1.5×105个/mL细胞密度接种于96孔板中，培养24 h后，随机分为正常对照组、模型组（650 μmol/L皮质酮）、实验组（650 μmol/L皮质酮加200 μmol/L单体化合物1～21），继续培养48 h。

2.2.3 MTT法检测单体化合物对皮质酮诱导的PC12细胞的保护作用

PC12细胞按照“1.3.3”项方法处理后，每孔加入25 μL MTT（5 mg/mL）继续作用4 h后，弃上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜，震摇10 min后，于酶标仪570 nm波长处检测吸光度值。

2.2.4 数据分析

所有实验数据进行one-way ANOVA比较分析，并釆用数据分析软件Graphpad Prism 5.03 Turkey′s t-test检验进行组间显著性分析，实验数据表示为（均值±标准差），当P＜0.05时，不同实验组间存在统计学意义。

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